前言

CRISPR/Cas9基因编辑技术是2020年年底刚刚获得诺贝尔奖的一项技术。基因编辑技术(genome editing technologies)通过核酸内切酶对DNA进行靶向切割产生DNA双链断裂(double strand breaks, DSB), 诱导体内细胞产生两种修复机制, 即非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组修复(homology directed repair, HDR), 并以这两种修复机制来对DSB进行修复, 从而实现基因靶向修饰。

CRISPR/Cas9系统构成

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌抵制外源核酸及噬菌体入侵的适应性免疫系统, 根据所编码效应蛋白的不同分成两大类。第一大类是由多个Cas蛋白组成的多亚基效应复合物, 包括I型、III型以及IV型。第二大类包括II型、V型以及VI型, 是由单个大的Cas蛋白组成的效应器复合体。第二大类II型CRISPR/Cas系统中研究最多且应用最广的是Cas9蛋白, 其通过碱基配对的方式与sgRNA(single guide RNA)形成Cas9蛋白复合物, 参与靶双链DNA的切割。CRISPR/SpCas9系统由SpCas9蛋白和sgRNA共同构成, 其中sgRNA可识别约20 nt的靶序列（图1）。Sp-Cas9蛋白由1 368个氨基酸组成, 结构主要分为REC lobe(recognition lobe)和NUC lobe(nuclease lobe), 连接REC lobe和NUC lobe的是富含精氨酸的BH(bridge helix)结构域。REC lobe由三个α螺旋结构域Helical-1、Helical-2和Helical-3组成。NUC lobe分别由RuvC结构域、HNH结构域和PI结构域(PAM-interacting domain)三个结构域组成, 其中RuvC结构域负责切割非目标链; HNH结构域负责切割目标链; PI结构域主要与PAM (protospacer adjacent motifs)的识别有关（图2）。

图1：SpCas9蛋白和sgRNA

图2：Cas9蛋白结构

CRISPR/Cas9系统的作用机制

当外源噬菌体侵染宿主细胞时 , 宿主细胞的CRISPR/Cas9系统通过 PAM来识别特定外源序列并进行加工, 随后将其插入特定位点。CRISPR基因座首先转录形pre-crRNA(precursor RNA), pre-crRNA再加工得到成熟crRNA(CRISPR RNA), 加工过程需要核酸内切酶的参与。此时成熟的crRNA与tracrRNA(trans-activating crRNA)结合组成sgRNA, Cas蛋白与sgRNA结合形成核糖核蛋白复合物, 该复合物通过与PAM的识别结合, 对外源核酸物质进行切割。保守的PAM序列通常用于系统进行自我与非我识别, 避免发生错误的自身切割, 最终使得宿主成功抵御外源遗传物质。

当Cas9-sgRNA复合物正确识别外源核酸上的PAM序列后, 靶双链DNA进行解旋使sgRNA在种子区域(seed region)与靶DNA序列结合, 从而形成了“R-loop”结构, 激活切割位点用于切割目标链与非目标链的双链DNA, 造成DNA双链断裂, 断裂处为平末端。当有外源同源重组模板DNA(donor DNA)存在时, 可依照同源片段对断裂位点进行精确修复, 此即为同源重组修复(homology directed repair, HDR), 而在不存在donor DNA时, DNA双链断裂将激发生物体内的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ), 在断裂处插入或缺失基因片段（图3）。